Técnica metagenômica é testada contra leishmaniose

Por Da Redação - agenusp@usp.br
 Publicado em 27/fevereiro/2012 |  Editoria : Ciências |  Imprimir | 

Da Assessoria de Comunicação do IFSC
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No Grupo de Cristalografia (GC) do Instituto de Física de São Carlos (IFSC), pesquisadores realizam testes com a técnica metagenômica para eliminar os protozoários causadores da leishmaniose. A técnica utiliza fragmentos de material genético que levem a produção de substâncias que matem os micro-organismos que provocam a doença. O objetivo é produzir um fármaco mais eficiente e com menos efeitos colaterais para as vítimas da leishmaniose, que atinge mais de 2 milhões de pessoas em todo o mundo.

Biblioteca Metagenômica reúne fragmentos de DNA utilizados em experimentos

A técnica trabalha com bactérias ambientais, que não são cultiváveis em laboratório. O começo do processo se dá pela coleta de amostras de solo que, por sua vez, abrigam inúmeros tipos de micro-organismos desconhecidos, que não podem ser cultivados em laboratório e por isso o seu DNA é isolado.

Na amostra de terra, os diversos micro-organismos presentes (que podem ser bactérias, fungos etc.) têm seu DNA extraído (direto da amostra). Por meio de enzimas de restrição, ele (DNA) é fragmentado (cortado em pedaços) e, finalmente, ligado a um vetor (cosmídeo). Resumindo, um pedaço de DNA do micro-organismo será inserido no cosmídeo, formando um plasmídeo recombinante. Esse recombinante é colocado em outra bactéria (E. Coli), esta, por sua vez, possível de ser cultivada em laboratório.

Tal procedimento é feito diversas vezes, com vários micro-organismos encontrados na amostra recolhida, o que resultará na chamada “Biblioteca Metagenômica”. “Uma das bibliotecas testadas contém 300 mil fragmentos de DNA diferentes e outra, que começa a ser analisada agora, tem 500 mil fragmentos de DNA dos micro-organismos encontrados em uma amostra”, conta Izaltina Silva-Jardim, pesquisadora e pós-doutoranda do IFSC.

Depois que a E. Coli recebe plasmídeo recombinante, ela é plaqueada (colocada na placa de Petri para crescer), os parasitas causadores da leishmaniose são plaqueados por cima das bactérias cultivadas, gerando uma co-cultura de bactérias e parasitas. Algum tempo depois, reações físicas entre eles serão observadas: onde a bactéria tiver produzido uma substância que mata a leishmania, tem-se um candidato à produção de fármaco. “Ao redor da bactéria que matou a leishmania podemos observar uma região mais translúcida”, aponta Izaltina.

Eficiência
Na Biblioteca de 300 mil clones (fragmentos de DNA) analisada por Izaltina, apenas 35 clones foram capazes de matar a leishmania. No entanto, devido a algumas interferências (como a bactéria ter crescido sob uma situação de estresse), pode ser que ocorram equívocos em relação a sua eficiência em matar o parasita. Portanto, os clones são retestados e, algumas vezes, o resultado não é animador. “Quando retestamos esses 35 clones, nenhum deles conseguiu matar a leishmania, efetivamente”, lamenta a pesquisadora.

Clone positivo com halo de inibição (à esquerda) e clones negativos (à direita)

No entanto, em colaboração com pesquisadores da Universidade Federal do Paraná (UFPR), em Curitiba, Izaltina teve acesso à outra Biblioteca Metagenômica (cedida pelo professor Emanuel Maltempi de Souza), onde encontrou 192 clones de amostras de micro-organismo de solo da Mata Atlântica e outras regiões, já isolados, mas dessa vez em meio líquido. “Agora, ao invés de plaquear as bactérias e esperar elas crescer e depois plaquear a leishmania por cima, fizemos diferente. Pegamos os clones e deixamos crescer em meio líquido”, diz. “Durante seu crescimento, a bactéria produziu substâncias e as jogou no meio. Esperamos cinco dias e depois separamos o líquido das bactérias e o colocamos na cultura de leishmania”.

Dos 192 clones, 13 deram ótima atividade, ou seja, depois de testados e retestados, cerca de 50% das leishmanias foram mortas pelas substâncias produzidas pelas bactérias e misturadas ao líquido. O próximo passo é, justamente, isolar todas as substâncias encontradas no líquido, para descobrir qual delas é a responsável pela morte da leishmania. “Quando isolamos essas substâncias, temos que isolar suas estruturas químicas e aí, então, poderemos saber de ‘quem’ se trata”, afirma Izaltina.

O DNA dos 13 clones positivos será sequenciado. “Nesse sequenciamento, podemos, às vezes, identificar de qual tipo de bactéria veio a substância para chegarmos a um produto único que poderá ser usado como remédio”, explica a pesquisadora. “A substância candidata ao fármaco deve matar a leishmania, mas sem afetar as células humanas”.

Portanto, ainda in vitro, testes são feitos com células saudáveis e infectadas de camundongos, depois disso com células humanas saudáveis e infectadas (paralelamente fazendo testes de toxicidade, farmacológicos etc.) com a substância. Considerando que todas as etapas tenham sido bem sucedidas e contando com aprovação de comitês de ética e agências de vigilância sanitária, iniciam-se os testes com humanos. “Começando por pacientes saudáveis e tendo observado que não houve efeitos colaterais nem reações negativas, passa-se aos pacientes infectados: primeiros grupos pequenos, depois grupos maiores. Tudo isso leva, em média, dez anos”, ressalta Izaltina.

Imagens: Assessoria de Comunicação do IFSC

Mais informações: email ijardim@hotmail.com, com Izaltina Silva-Jardim